PCR技術的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系,所以根據(jù)終的PCR產物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產物結合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產物會影響結果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。 產品名稱 | 羊口瘡病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Orf Virus(ORFV) | 貨號 | YSP97022 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結合到模板上,探針的結合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結合的問題,反應結束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術的缺點: 成本高; 設計難度大; 只能用于檢測產物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化。而在平臺期,擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系,根據(jù)終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 保護素(CD59)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97%,含碳酸鉀穩(wěn)定劑 硬結節(jié)桿菌 1g 吻素1(KISS1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97%,含碳酸鉀穩(wěn)定劑 Massilia dura 5g 胰高血糖素樣肽2(GLP2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) D,99% 宇佐美曲霉 1g Ⅰ型膠原α1(COL1α1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 中慢生華癸根瘤菌 100g Ⅺ型膠原α1(COL11α1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 島生坂野酵母 25g 透明質酸結合蛋白2(HABP2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 香菇 5g 癌胚抗原相關細胞粘附分子7(CEACAM7)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 假單胞菌 100mg 纖維蛋白原相關蛋白1(FGL1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) tech.85% 膠孢 25g 脂解激活脂蛋白受體(LSR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) tech.85% 金色毛殼 5g 絲氨酸蛋白酶8(PRSS8)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% Pseudomonas plecoglossicida 10g 橋粒芯膠粘蛋白1(DSC1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥97% Xenorhabdus 1g G蛋白偶聯(lián)受體37(GPR37)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 阿氏芽孢桿菌 1g 轉鈷胺素蛋白Ⅰ(TCN1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大腸桿菌 5g 分層蛋白(SFN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98% 釀酒酵母 1g 游離甲狀腺素(fT4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 非無菌藥品 沙門菌(陽性) 1g 凝血酶原片段F1+2(F1+2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 費氏中華根瘤菌 5g 輕肽鐵蛋白(FTL)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 枝狀枝孢 10ml 肌球蛋白ⅤA(MYO5A)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 稻平臍蠕孢 50ml 羊口瘡病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒CD19抗體Goat human IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗IgG100 ul 酸化CD19抗體Goat human IgM/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗IgM100 ul 淋巴細胞趨化因子CCL21抗體Goat mouse IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗IgG100 ul 細胞表面趨化因子受體2A抗體Goat mouse IgM/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗IgM100 ul 細胞表面趨化因子受體2B抗體Goat rat IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗IgG20 ul 細胞表面趨化因子受體2抗體Goat Guinea IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗豚鼠IgG100 ul 金屬肽鏈內切酶抗體Goat Rabbit IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG20 ul 鈣介質素抗體Goat Bovine IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗牛IgG100 ul 細胞表面趨化因子受體6抗體Goat Chicken IgG/HRP 辣根過氧化物酶標記羊抗雞IgG100 ul |