PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。 PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡(jiǎn)便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價(jià)格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性 非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問(wèn)題可以通過(guò)熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過(guò)PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來(lái)說(shuō),SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 精氨酸支原體探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒 | 英文名稱 | Mycoplasma arginini | 貨號(hào) | YSP96965 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為T(mén)aqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái),從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問(wèn)題,反應(yīng)結(jié)束后無(wú)需通過(guò)熔解曲線檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計(jì)難度大; 只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來(lái)也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 人血管抑素/血管穩(wěn)定蛋白(ANG)ELISA試劑盒 英文名稱:Human angiostatin,ANG ELISA Kit進(jìn)口/分裝 人血紅蛋白C(HbC)ELISA試劑盒 英文名稱:Human Hemoglobin C,HbC ELISA Kit進(jìn)口/分裝 Tetracycline/OVA 四環(huán)素偶聯(lián)雞卵白蛋白Multi-class antibodies規(guī)格: 2mg Anti-CEA 癌胚抗原抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml Rhesus antibody Rh ODC 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗體 規(guī)格 0.2ml Western Transfer Buffer 電轉(zhuǎn)移緩沖液(Western轉(zhuǎn)膜液 粉劑) 1L Tyk2 英文名稱: 非受體酪酸蛋白激酶2抗體 0.2ml C11orf65 英文名稱: 11號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框65抗體 0.2ml Anti-Phospho-IRF3 (Ser396) 酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml GLUT1(Human Glucose transporter 1) ELISA Kit 人葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1Multi-class antibodies規(guī)格: 48T Anti-Phospho-MEF2A (Thr312) 酸化肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml Rhesus antibody Rh Jagged1/CD339 Jagged1/CD339抗體 規(guī)格 0.1ml PT(Human Pertussiu Toxin) ELISA Kit 人百日咳毒素 96T PMCA1 英文名稱: 細(xì)胞膜鈣ATP酶1抗體 0.2ml 無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員9A 多克隆抗體WNT9A Polyclonal Antibody700/30ul#1540/100ul#2520/200ul 無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員9B 多克隆抗體WNT9B Polyclonal Antibody700/30ul#1540/100ul#2520/200ul 胚性腺肌肉瘤1 多克隆抗體WT1 Polyclonal Antibody700/30ul#1540/100ul#2520/200ul 含WW域轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白1 多克隆抗體WWTR1 Polyclonal Antibody700/30ul#1540/100ul#2520/200ul 趨化因子(C基元)配體2 多克隆抗體XCL2 Polyclonal Antibody700/30ul#1540/100ul#2520/200ul XC趨化因子受體1 多克隆抗體XCR1 Polyclonal Antibody700/30ul#1540/100ul#2520/200ul 精氨酸支原體探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒CD36抗體Shank1/FITC 熒光素標(biāo)記shank-1抗體IgG300 ul 固酮合成酶CYP11B2抗體SHBG /FITC 熒光素標(biāo)記性激素結(jié)合球蛋白抗體IgG100 ul 7號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框16抗體Shh/FITC 熒光素標(biāo)記Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路膜蛋白受體抗體IgG100 ul 10號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框62抗體Shiga-like toxin IIe variant subunit A/FITC 熒光素標(biāo)記抗豬水腫病大腸桿菌志賀樣毒素Ⅱ型突變體(O139菌株)抗體IgG100 ul 胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白SHC/FITC 熒光素標(biāo)記SH2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化蛋白1抗體IgG100 ul 酪蛋白激酶casein kinase Iα抗體phospho-SHC (Tyr239/240)/FITC 熒光素標(biāo)記酸化SH2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化蛋白1抗體IgG100 ul 酸化酪蛋白激酶casein kinase Iα抗體phospho-SHC (Ser36) /FITC 熒光素標(biāo)記酸化SH2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化蛋白1抗體IgG100 ul 酸化酪蛋白激酶casein kinase Iα抗體phospho-SHC (Tyr349) /FITC 熒光素標(biāo)記酸化SH2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化蛋白1抗體IgG100 ul 肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白CAPG抗體phospho-SHC (Tyr427) /FITC 熒光素標(biāo)記酸化SH2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化蛋白1抗體IgG100 ul |